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食道癌细胞系中干细胞美容样SP体细胞的分离出来评定试验


发布时间: 2019-09-20
  食道癌细胞系中干细胞美容样SP体细胞的分离出来评定试验

 食道癌细胞系指由食道鳞状上皮细胞或腺上皮细胞的出现异常增长所产生的恶变变病。其发展趋势通常历经上皮细胞肠上皮化生、原位癌、侵润癌等环节。

 试验材料人食道癌细胞系

 实验试剂、试剂盒胰酶RNA酶碘化丙啶四甲基偶氮唑盐小牛血清DMEMDMSOK2HPO4Na2HPO4NaCI

 仪器设备、耗品无菌检测分选机管400目体细胞筛水浴锅离心脱水机酶标仪电泳仪光学显微镜PCR仪

 试验流程

 一、原材料提前准备

 1.  头孢类存储液

 (1)将头孢类小瓶中的80万企业的粉剂充足融解于8 ml双蒸水中。

 (2)预包装为1 ml/管,-20℃储存。

 2.  链霉素存储液

 (1)将键霉素小瓶中的1 mg粉剂充足融解于10 ml双蒸水中。

 (2)预包装为1 ml/管,-20℃储存。

 3.  RPMI 1640培养液

 (1)在大三角瓶中装进800 ml 双蒸水。

 (2)添加1袋RPMI1640粉剂制荆,于搅拌装置上搅拌。

 (3)添加2.0 g Na2HCO3,1 ml 10万unit/ml 的头孢类存储液。

 (4)1 ml 充足融解后,调整pH值至7.4,双蒸水定容为1000 ml。

 (5)无菌检测标准下0.22 um 直径滤纸过虑后分设备于4℃储存。

 4.  UltraMEM细胞培养液

 (1)500 ml UltraMEM中添加无菌检测的10 ng/ml bFGF、10 ng/ml EGF、50U/ml头孢类和50 ug/ml 链霉素,4℃储存。

 (2)因为彻底无血细胞情况不利体细胞生长发育,人们在该细胞培养液中添加5%的FBS,保持FBS呈较低空。

 5.  1×PBS (pH 7.4)

 (1)在800 ml双蒸水中融解1.15g Na2HPO4、0.2 g K2HPO4、8.0 g NaCl和0.2 g KCl。

 (2)用1 M HC1调pH值至7.4,放水定容为1000 ml。

 6.  EGF:用1 ml 无菌检测水融解安培内的100 ug EGF,分为10管,取1管稀释液100倍预包装成小份做为工作液,其他9管做为储藏液,均放置-20℃储存。

 7.  bFGF

 (1)用1 ml Tris缓冲液充足融解安培内的10 ug bFGF

 (2)预包装成10管,每管以PBS稀释液10倍后预包装成小份做为工作液,放置-20℃储存。

 8.  0.25%胰酶

 (1)称量胰酶0.25 g,以1x PBS 100 ml融解。

 (2)无菌检测标准下0.22 um 直径滤纸过虑后放置4℃储存。

 9.  5 mg/ml 四甲基偶氮唑盐(MTT)

 (1)0.5 g MTT颗粒剂添加100 ml PBS沐浴液中充足融解。

 (2)无菌检测标准下0.22um直径滤纸过虑后分设备于-20℃储存。

 10.  细胞冻存液:DMSO:FBS=1:9,-20℃储存。

 11.  Hoechst 33342

 (1)将10 mg Hoechst 33342颗粒剂以无菌检测水1ml 融解做为存储液。

 (2)取下10 ul稀释液到40 ul做为工作液,两者均遮光,-20℃储存。

 12.  碘化丙啶(PI)

 (1)将25 mg PI颗粒剂以1×PBS缓冲液250 ml 遮光拌和至充足融解。

 (2)获得终浓度值为l00 ug/ml 的存储液,过虑预包装后放置4℃遮光储存。

 13.  10 mg/ml RNA酶

 (1)将胰RNA酶融解于有机溶剂中[10 mM Tris-HCl(pH 7.5),15 mM NaCl],浓度值为10 mg/ml。

 (2)放置100℃15 min,迟缓水冷却至室内温度后预包装为200 ul/支,储存于-20℃。

 14.  Verapamil配置

 (1)用DMSO配浓度值为50 mg/ml 的源液。

 (2)从参考文献获知运用液的浓度值是100 umol/ml。

 (3)因此将源液稀释液50倍后就能够获得浓度值为100 umol/ml运用浓度值。

 (4)试验中依照每ml体细胞悬浮液中添加10 uL 的源液就能超过阻隔离予安全通道需要的浓度值。

 二、试验流程

 1.  流式细胞仪分选机方式:

 (1) 0.25%胰蛋白酶消化吸收处在多数成长期的喉癌体细胞,1200 rpm/min,抽滤5 min,弃上清后添加5 ml PBS重悬体细胞,抽滤清洗2次。

 (2)以冰预冷的含2% FBS RPMI 1640彻底细胞培养液重悬体细胞,调节浓度值为1×106个/ml,于37℃恒温箱中孵育10分鐘。

 (3)添加浓度值为7.5 ug/ul 的荧光染料Hoechst 33342至终浓度值5 ug/ml,遮光,于37℃恒温箱中孵育90分鐘,中断搅拌以防体细胞沉底。

 (4)超低温抽滤,4℃,1200 rpm/min,5 min,弃上清。

 (5)2 ml PBS重悬,1200 rpm/min,5 min。

 (6)用2~4 ml RPMI1640细胞培养液重悬体细胞,以400目髙压**后的体细胞筛筛粉体细胞,去除黏连体细胞团。

 (7)于上流式细胞仪前5分鐘添加浓度值为50 ug/ml 的PI超过终浓度值为1~2 ug/ml,遮光标识体细胞。

 (8)上机操作剖析或分选机。 2.  结晶紫染色剂流程:

 (1)用PBS清理每孔2次,除去细胞培养液中的蛋白质成分。

 (2)每孔添加1.5 ml 100%酒精,室内温度固定不动15分鐘。

 (3)PBS清理2次,每孔添加1 ml 4%的结晶紫染剂.室内温度功效15分鐘。

 (4)水流迟缓洗掉不必要染剂,于吸水纸上控干水份,记数体细胞数超过50个的复制总数并测算CFE。

 3.  多向分裂及其自身升级工作能力科学研究:

 (1)分选机后SP和NSP体细胞各自打疫苗于塑造瓶中。

 (2)塑造2周,超过再度剖析的体细胞数量后搜集体细胞做Hoechst 33342染色剂,剖析SP体细胞占比高矮。’

 4.  体细胞总RNA获取:

 (1)选用Trizol Reagent获取体细胞RNA。取生长发育情况优良的SP和NSP体细胞,弃去细胞培养液,0.25%的胰酶消化吸收体细胞,用无菌检测PBS洗2次,添加1 ml Trizol,带体细胞裂解后移进EP管,室内温度静放5 min。

 (2)添加0.3 ml 氯仿,错乱搅拌EP管15 sec,室内温度静放3 min,4℃12 000 g抽滤10 min,迟缓汲取上清于另一个EP管内。

 (3)添加0.75 ml异丙醇,搅拌,室内温度静放10 min,4℃12 000 g抽滤10 min,弃上清。

 (4)添加75%酒精(用DEPC解决过的双蒸水来配置),混和,4℃,7 500 g 抽滤5 min,弃上清。

 (5)室内温度干躁,添加20 ul 经DEPC解决双蒸水,55℃~60℃水浴10 min 助融,以1:25稀释液后检验260:280比率及其RNA浓度值,预包装,-80℃电冰箱储存预留。

 5.  小白鼠身体成瘤实验

 (1)先加未分选的EC-9706体细胞做预试验来明确打疫苗体细胞数量,选择地总数各自为1×106,1×105和1×104,周围后观查恶性肿瘤产生状况。

 (2)将当日早上分选机所获得的SP和NSP体细胞**圮数后重悬在RPMI-1640细胞培养液中,分6组打疫苗体细胞,打疫苗容积为100 ul。

 (3)于4℃储存在小动物房内各自打针于NOD/SCID小白鼠腋窝下,每一使用量3只小白鼠,SP和NSP体细胞共24只小白鼠。

 (4)喂养4~9周,每星期观查2次恶性肿瘤生长发育状况。

 (5)处决前要千分尺**测量恶性肿瘤尺寸,采用断颈法处决小白鼠,照相取下瘤机构。

 (6)剪取一部分用10%福尔马林溶液侵泡固定不动,切开开展HE染色剂明确病理学种类。

 6.  Western Blot剖析目地蛋白质:

 (1)体细胞总蛋白的获取

 ①提前准备冰盒,下列实际操作尽可能在雪上进行。

 ②用冰预冷的PBS洗掉细胞培养皿中残留的细胞培养液。

 ③添加1 ml PBS,用体细胞刮将体细胞刮下来,搜集于EP管内,1500 rpm/min,抽滤5 min 或是1800 rpm/min,抽滤3 min。

 ④迟缓吸掉上清液,于下一层体细胞沉定中添加1 ml 体细胞裂解液将体细胞裂解,搅拌后于雪上置放*少45 min,随后于超低温超速离心机上4℃,12000 m/min,抽滤5 min。

 ⑤汲取上清,预包装并检验蛋白质浓度值。

 (2)标准曲线的绘图及其试品蛋白质的浓度值测量

 ①BSA蛋白质生活品的稀释液:将浓度值为2000 ug/ml 的源液逐渐稀释液获得浓度值各自为1500 ug/m,1000 ug/m,750 ug/m,500 ug/m,250 ug/m,125 ug/m和25 ug/ml的生活品梯度方向。

 ②配置工作液:依照使用说明书将A液50容积与B液1容积混和。

 ③取5 ul 生活品或试品,加100 ul 的工作液,室内温度搅拌30秒。

 ④37℃孵育30 min 后降到室内温度,于570 nm 光波长下测OD值,绘图标准曲线并依据稀释液陪数测算蛋白质试品的浓度值。

 7.  **荧光法分析体细胞蛋白质分子结构表述:

 (1)当心将解决好的盖玻片用钳子捏住放进六孔板板中,将分选机接到的SP和NSP体细胞各自滴加进影片上,运用界面张力将液体操纵在影片范围之内,静放20~30 min,待体细胞贴壁后轻轻地添加细胞培养液(留意不必使影片浮上来),放进恒温箱中塑造留宿。

 (2)隔日,弃去孔中细胞培养液,PBS洗3次,添加10%室内甲醛,4℃固定不动30 min。

 (3)PBS洗3次除去多聚甲醛,每孔添加1 ml 5%牛血清白蛋白室内温度孵育2 h 封闭式,阻隔非非特异IgG融合。

 (4)PBS洗2次,取适量CD44和CK18一抗,置放于摇床边4℃留宿。

 (5)用PBS-T(带有0.02%Tween 20的PBS)清洗3次,添加莹光二抗适当,放进暗装底中,放置摇床边室内温度融合2钟头。

 (6)PBS-T清洗3次,用带有0.5 mg/ml DAPI 的封片液将盖玻片固定不动于载玻片上,放进暗装底中遮光储存。

(7)于Olympus正置光学显微镜下观查体细胞莹光抗压强度,纪录照相。

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