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实验方法原理胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞


发布时间: 2019-11-16
     实验方法原理胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在*少量的培养基内选择(第3步),在有bFGF存在的情况下扩增(第4步)并*终分化在第5步。细胞全程培养在37℃,5%CO2,100%湿度条件下。一般体外诱导向神经细胞方向分化,也可以采用低浓度的RA进行诱导。
  实验材料小鼠
  试剂、试剂盒明胶PBSDMEM马血清L-谷氨酰胺HEPESβ-巯基乙醇PESTLIF
  仪器、耗材培养板离心管水浴锅离心机6孔板24孔板
小鼠胚胎干细胞实验步骤
一、ES培养基
 
  在LIF存在的条件下维持细胞培养。
 
二、EB培养基
 
使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
 
  1.  分散纯化细胞(参见上面的细胞传代部分)。
 
  2.  纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中,计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。
 
  3.  用2mlEB培养基重悬细胞,吹打至少10次制成单细胞悬液
 
  4.  一个15 cm的细菌培养皿接种4~5×106个细胞(1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿)。
 
  5.  2天后更换培养基,将胚状体转入锥形管中放置3~5分钟使细胞沉降。弃去上清,将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
 
  6.  用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中(这即是细胞的移植步骤)。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿,在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
 
  7.  形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。
 
三、ITSFn培养基
 
  在*少量培养基中选择神经前体细胞
 
  1.  胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。
 
  2.  并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附,因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
 
  3.  保持细胞在ITSFn中培养大约10天,根据需要更换培养基--大约每隔一天。
 
  4.  观察细胞形态,神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时,转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现个清晰的标志几天以后,通常是在第3步的第6到第10天。
 
四、N3培养基+bFGF
 
  小鼠胚胎干细胞通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
 
  1.  PBS洗涤,加入1-2 ml 胰酶。
 
  2.  37℃孵育5分钟。
 
  3.  用4mlEB培养基终止胰酶活*,将细胞转入锥形管中放置3~5分钟移出细胞团,将上清移入一新的离心管离心。
 
  4.  将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
 
  5.  将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上(将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板,6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个,以使可能的获得样品数量)。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106 /孔。
 
  6.  2天后更换培养基。
 
五、N3培养基 
 
通过撤除bFGF使神经前体细胞分化。
 
  1.  细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基。
 
  2.  根据需要换液(大约每隔一天)。
 
  3.  分化10~15天后固定细胞。
 
  4.  移除培养基。
 
  5.  PBS洗涤,加入4%福尔马林,室温放置30分钟,PBS洗涤2次储存于PBS。
 
  6.  长期储存使用含0.01%叠氮化纳的PBS。
 
六、移植细胞的准备
 
  细胞在胚状体形成4天以后被移植(相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板)。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10 cm的培养皿。
 
  1.  将胚状体转移至一15 ml 圆锥形管中放置3~5分钟使胚状体沉降下来。细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞(包括死细胞)而这些细胞可以被离心下来。
 
  2.  去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中。
 
  2.  离心3分钟。
 
  3.  去除上清加入1×胰酶(10 cm的培养皿加1 ml)。
 
  4.  37℃水浴5分钟。
 
  5.  加入5 mlEB培养基小心吹打约10次。
 
  6.  小心处理细胞很重要,进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。
 
  7.  离心2分钟。
 
  8.  吸出上清将细胞重悬于500 μl EB培养基。
 
  9.  用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次。
 
  10.  离心2次。
 
  11.  吸出上清将细胞重悬于100 μl EB培养基。
 
七、烟酸己可碱标记ES细胞进行移植
 
  1.  准备一10 μg/ml的烟酸已可碱染液(双苯酰亚胺,在冷冻室118)。
 
  2.  加入1 mg(你能称到的*小量)到5 ml EB培养基(制成200 μg/ml)。
 
  3.  将溶液稀释成10 μg/ml (100 μl  200 μg/ml 溶液和1.9 ml EB培养基)。
 
  4.  如前所述将细胞重悬于2 ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液。
 
  5.  将悬液置于室温(或冰上)30分钟。
 
  6.  离心2分钟。
 
  7.  吸出上清将细胞重悬于2 ml EB培养基。
 
  8.  重复一次。
 
  9.  离心2分钟。
 
  10.  吸出上清将细胞重悬于100 μl EB培养基并置于冰上。

注意事项
  1.需要采用高纯度的水进行培养细胞。
 
  2. 必须要在无菌的环境下操作实验。
 
其他
  1. 在没有添加LIF的条件下,培养在饲养层上的ES细胞克隆形成率和AKP染色阳性度显著高于无饲养层培养的ES细胞。
 
  2. 在LIF添加量达到l000IU/ml时,外源LIF与饲养层产生的基质型LIF在维持未分化状态作用中存在有主从关系。
 
  3. 当没有外源LIF或量不足时,饲养层产生的分化抑制作用才会在分化抑制中发挥主要作用。 
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