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人毛细血管内皮细胞


发布时间: 2019-11-16
 (人毛细血管内皮细胞)实验材料样品
试剂、试剂盒PBS两性霉素庆大霉素
仪器、耗材大剪刀刮刀烧瓶钢筛网离心管层流柜
(人毛细血管内皮细胞)实验步骤
1. 准备下列器械并消毒(高压灭菌,或者可能的话一次性使用):
 
大剪刀(两把)
 
刮刀(两或三把)
 
胰蛋白酶消化的烧瓶(每 30 g 绞碎样品一个)
 
带接液器的 250-μM 钢筛网
 
15-ml 和 50-ml 离心管
 
2. 分离组织样品。所有操作在层流柜中进行。
 
(1) 从腹整形样品分离
 
① 解剖样品,去除任何皮肤、筋膜、肌肉等,只保留脂肪组织。称重样品,每 10 g 分装一份。
 
② 在无菌盘上,用剪刀将样品剪碎。
 
③ 用 60 ml 注射器(不带针头)吹吸样品,反复3次或至样品充分液化。
 
④ 取 20 ml 组织放入装有 20 ml PBS 的 50 ml 离心管,混匀,700 r/min 离心 5 分钟吸出含血水相,重复操作,直至样品相对无血。
 
(2) 从吸脂样品分离
 
① 置真空包装样品于筛网上,用含 0.5 μg/ml 两性霉素和 200 IU/ml 庆大霉素,200 μg/ml 链霉素的 PBS 反复冲洗。冲洗过程中用刮刀在被冲洗物周围搅动,辅助冲洗。
 
② 取 20 ml 组织放入装有 20 ml PBS 的 50 ml 离心管,混匀,700  r/min 离心 5 分钟。吸掉含血水相。
 
3. PBS 溶解 BSA 至终浓度 4.0 mg/ml(PBS/BSA);过滤除菌。配制胶原酶溶液,PBS/BSA 溶解胶原酶和 DNA 酶,终浓度分别为 4.0 mg/ml 和 0.02 mg/ml,0.2 μM 滤膜过滤除菌。
 
10 ml 溶液大约可以处理 10 ml 脂肪样品。
 
4. 用无菌刮刀把步骤2中剪碎的脂肪组织刮到胰蛋白酶消化的烧瓶中,然后加入胶原酶,每毫升组织加 1 ml。
 
5. 37℃ 80 r/min 旋动保温 30 分钟。
 
6. 消化的同时,用 PBS 稀释 PBS/BSA(4.0 mg/ml BSA)至 BSA 终浓度 0.2 mg/ml。
 
7. 消化样品倒入 50 ml 离心管(每管约 20 ml)。
 
8. 吊筒式医用台式离心机室温 1500 r/min 离心 5 分钟。
 
9. 液态脂和水相倒入另一 50 ml 离心管。由于细胞沉淀极易被倒掉,使用无菌离心管。
 
10. 细胞重悬于 5 ml PBS(0.2 mg/ml BSA),1500 r/min 离心 5 分钟,倒掉上清。沉淀悬于 1 ml 含 5% FCS 的 PBS(PBS/FCS)中。 
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