将培养皿在塑造箱里置放 2 h 左右，至体细胞打疫苗

丘脑颗粒细胞试验方式基本原理将 4~8 只新生儿鼠的丘脑切割成小立方米块，放进 HBSS，在 37°C 标准下要胰蛋白酶消化吸收 15 min。将体细胞打疫苗于有涂 L-多聚赖氨酸的培养皿或塑造瓶。

试验原材料DMEMHBSSL-多聚赖氨酸阿糖胞苷0.025% 胰蛋白酶硅酮

仪器设备、耗品P e tr i培养皿解剖刀解剖学剪解剖学镊Pasteur塑料吸管10ml塑料吸管试管婴儿水浴箱

丘脑颗粒细胞试验流程

1. 在无菌检测标准下摘除丘脑，放进 HBSS（带有 3 g/L BSA）。

2. 用解剖刀将脑部切割成约 0.5 mm3 尺寸的正方体。

3. 将机构块移进 12 ml 试管婴儿，用 HBSS 洗 3 次。每一次清洗后让机构块沉在试管婴儿底端。

4. 添加 10 ml 用 HBSS 配置的 0.025 % 胰蛋白酶（用 HBSS 配置），在 37°C 标准下要水浴箱孵育 15 min。

5. 将胰蛋白酶消化吸收的脑部移进 50 ml 离心管，随后添加 20 ml 生长发育细胞培养液，以停止胰蛋白酶的消化吸收功效。

6. 根据用硅化的 Pasteur 塑料吸管碾磨使机构分散化，直到得到单细胞悬浮液。

硅化 Pasteur 塑料吸管：

(a)用双蒸水将硅酮液稀释液为 0.1%~1%；

(b)将塑料吸管浸人硅酮液或用硅酮液清洗塑料吸管板内面；

(c)置放 24 h 晾晒或在 100°C 标准下置放十多分钟使塑料吸管变干；

(d)将塑料吸管干热灭菌。

用 L-多聚赖氨酸解决培养皿：

(a)用双蒸水融解 L-多聚赖氨酸（10 mg/L）；

(b)将化合物过滤除菌；

(c)每一 35 mm Petri 培养皿内添加 1 ml L-多聚赖氨酸液；

(d)10~15 min 后吸出来 L-多聚赖氨酸液，添加 1~15 ml 细胞培养液；

(e)将培养皿在塑造箱里置放 2 h 左右，至体细胞打疫苗。

7. 将盛满体细胞悬浮液的离心管放 3~5 min，让小的机构团块沉在试管婴儿底。随后，用 Pasteur 塑料吸管吸出来机构团块。

8. 将单细胞悬浮液抽滤（200 g ，5 min ) 后，吸出来上清液。

9. 用生长发育细胞培养液混悬体细胞团，随后打疫苗体细胞，每一培养皿的体细胞相对密度为 2.5×106~3.0×106 个。

10. 塑造 2~4 d 后（二天后*佳），添加 5~10 μmol/L 阿糖胞苷，再次塑造 24 h。

11. 用 DMEM （带有 30 mmol/L 果糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、24.5 mmol/L 氯化钾、100 mU/L 甘精胰岛素（Sigma，Ⅰ-1882）、7 μmol/L 对氨基苯甲酸（Sigma，A -3659）、100 μg/ml 庆大霉素和 10 % 加温消灭的 FCS）换液。

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