乙状结肠直肠肿瘤体细胞的塑造

乙状结肠直肠肿瘤体细胞的塑造

试验方式基本原理一般用酶消化吸收囊腺瘤，用手术刀片将癌机构剁碎。假如分裂优良的乙状结肠胃癌标本采集割开后仍不容易分离出来体细胞，能用酶消化吸收方式分离出来。

试验原材料用以传代培养的Dispase实验试剂、试剂盒生长发育细胞培养液洗剂消化酶仪器设备、耗品塑造瓶

试验流程（乙状结肠直肠肿瘤体细胞）

一、酶消化吸收

1. 用洗剂（洗剂：加上 5% FBS、200 U/ml 头孢类、200 μg/ml 链霉素和 50 μg/ml 庆大霉素。在原代塑造时，庆大霉素的功效*少保持七天，随后去除。）清理恶性肿瘤标本采集 4 次。

2. 将机构块放进少量洗剂中，洗剂正好浸入机构块（防止机构干）。用交差的手术刀片或锐利手术剪将机构块剖成约 1 mm3 一块块。

3. 根据用台式离心机抽滤（300 g，3 min），将机构块清理 4 次。清理频次以工作经验而定，并依据体细胞环境污染状况。

4. 将机构块放进消化酶（消化酶：DMEM，加上的抗菌药同洗剂，并加上 1.5 mg/ml 胶原蛋白酶（ IV型，Worthington）、0.25 mg/ml 透明质酸酶（ I 型，Sigma）和 2.5%~5% FBS。虽然常见 Worthington 企业生产制造的胶原蛋白酶，也可使用 Sigma 企业生产制造的塑造级別的胶原蛋白酶。），在 37℃ 标准下晃动，一般留宿（约 12~16 h )。因为消化吸收是1个迟缓全过程，机构块在消化酶中的時间是多少并没事儿，关键的是再此全过程中不许消化酶变成酸碱性。低 pH 表明机构块在消化酶中的時间太长或放进消化酶中的机构块过多。将约 1 cm3 恶性肿瘤机构放进 20~40 ml 消化酶。

二、非酶消化吸收

囊腺瘤一直必须用酶消化吸收。殊不知，常发觉再用手术刀片将癌机构切割成 1 mm3 、时小的体细胞簇从恶性肿瘤机构掉下来入洗剂中。在这样的事情，可按以下流程实际操作。

1. 搜集带有掉下来体细胞簇的洗剂。

2. 将离心管置放十多分钟，根据作用力使体细胞簇地基沉降，将机构块与小的体细胞簇分离。

3. 吸出来上清液。

4. 立即塑造剩余机构块，或是将机构块放进洗剂内，轻轻摇晃 30~60 min，便于使大量的小细胞簇脱落下来，随后搜集体细胞簇，栽种于培养皿内，与剩下的机构块分离塑造。

5. 在栽种于培养皿内以前，将全部标本采集洗 3 次。

三、原代塑造的规范标准

1. 在预涂胶原蛋白粉和栽种喂养体细胞的 25 cm2 塑造瓶，用 4 ml 细胞培养液塑造从恶性肿瘤机构分离出来的上皮细胞性小管和体细胞簇。

2. 在带有 5% CO2 和 37 ℃ 的塑造箱里塑造。

3 . 每星期换细胞培养液2次。

小管和体细胞在 1~2 d 内刚开始粘附底物，鳞状上皮细胞转移出去。大部分小管和小的上皮细胞块在 7 d 内贴壁，但大的类****物必须 6 周能够贴壁，虽然贴壁時间有一定的转变。

假如将体细胞打疫苗于预涂胶原蛋白粉的塑造瓶（Biocoat，B-D Biosciences），在原代塑造全过程中上皮细胞非常容易贴壁。与无 3T3 词养层对比，将体细胞打疫苗于 3T3 喂养层处时体细胞生长发育很好。当鳞状上皮细胞复制扩升至每一复制有几十个体细胞时，他们越来越不取决于 3T3 喂养层，故无须再添加词养层体细胞。

四、继代塑造和测序

不可以用基本的胰蛋白酶和 EDTA 溶液解决方式对大部分乙状结肠直肠腺瘤的原代体细胞和囊腺瘤细胞系开展传代 [ Paraskeva et al.， 1984，1985 ]。因为用 0.1 % 胰蛋白酶（用 0.25 mmol/L EDTA 配置）将囊腺瘤体细胞分散化为单细胞造成体细胞生长发育很差，故改用 Dispase。

1. 将 Dispase 液注于体细胞单面上，正好浸入体细胞（每一 25 cm2 塑造瓶约 2.5 ml）。对原代体细胞解决 40~60 min，而对细胞系解决 20~40 min。

2. —旦鳞状上皮细胞层刚开始去粘附（去粘附的是体细胞片，而并不是单细胞），用塑料吸管吹打，以推动去粘附，使体细胞片分散化成体细胞簇。

3. 在规范的塑造标准下清理和栽种体细胞。几日后体细胞簇去粘附，故应轻轻地换液。

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