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实验试剂说明

  实验试剂、试剂盒凡士林液态氮MgCl2•6 H2O硫酸铵HeLa 体细胞硫酸铵缓存盐溶液(PBS) 缓冲液 G缓冲液 H 缓冲液 DTM 缓冲液+0.1 ml L KCl

 试验流程

 原材料

 HeLa 体细胞(塑造和储存标准见下文。人们也取得成功地应用过 CellexBiosciences 企业制取并冷藏的 HeLa 体细胞)

 凡士林

 液态氮

 MgCl2·6 H2O

 硫酸铵

 实验试剂

 硫酸铵缓存盐溶液(PBS)

 缓冲液 G

 缓冲液 H

 缓冲液 D

 TM 缓冲液+0.1 ml/L KCl

 (秘方,见"实验试剂的配置",PP.131~138)

 操作流程

 HeLa 体细胞的塑造与储存(12-L 经营规模)

 1)HeLa 体细胞多数生长发育至相对密度为 5X105 个体细胞/ml, 柔和搜集细狍以防裂解。

 2) 体细胞用 PBS 清洗一回,并再度搜集。

 3) 对每升初始细胞培养液个人所得之体细胞加 2 ml 缓冲液 G(即,对由 12L 细胞培养液获得的体细胞加 24 ml 缓冲液,再添加凡士林至凡士林的终浓度值为 20%(v/v)。比如,由 12L 细胞培养液必得大概 18 ml 容积的体细胞,添加 24 ml 缓冲液 G 后,总容积达 42 ml。但是因为体细胞占了必须容积进而凡士林浓度值仅为 17.1%,故务必再添加 1.5 ml 凡士林,使凡士林的终浓度值达 20%。

 4) 将体细胞置液态氮中冷藏,存储于-80℃ HeLa 细胞质的制取(12-L 经营规模)

 除非常表明者外,全部水溶液均应维持于 4℃,全部实际操作亦应在 4℃ 下开展。

 1) 室内温度下,将 HeLa 体细胞(由 12L 体细胞相对密度约为 5X105 个体细胞/ml 的细胞培养液个人所得之体细胞置水里解除冻结。应尽量快地使体细胞解除冻结,但不适合使体细胞溫度超出 4℃。添加含 lg MgCl2·6 H20/L 的 PBS,至终容积为 200 ml, 再用 BeckmanGSA 扭头,3000r/min 抽滤 10 min, 搜集体细胞。

 2) 用 200 ml 含 1g/L MgCl2·6 H20 的 1XPBS 清洗体细胞,用 BeckmanGSA 扭头,3000r/min 抽滤 10 min, 搜集体细胞。

 3) 体细胞重悬在 60 ml 缓冲液 H。

 4) 体细胞置雪上孵育 15~30 min。

 5) 用 Dounce 氏匀浆器(40 ml) 及 B 杵粉碎澎涨的体细胞,碾磨 20 次。

 注:关键的是体细胞裂解后的实际操作要快,使转录因子因泄露至核外而导致的损害减为*小。事实上,在胞质多组分抽滤搜集细胞质时的上清液中普遍有高浓的核转录因子。因而. 提升清洗和抽滤的频次因此会使转录因子的得率减少。

 6) 用 BeckmanSS-34 扭头,3500r/min 抽滤 10 min, 搜集细胞质。马上制取核提取液。从 12LHela 细胞培养液通常可得到约 12 g 细胞质。HeLa 体细胞梭提取液的制取(12-L 经营规模)

 除非常表明者外,全部水溶液均应维持于 4℃,全部实际操作亦应在 4℃ 下开展。

 1) 取由 12LHeLa 细胞培养液制取的细胞质(如上所述或在凉水(4℃) 中解除冻结这份冻存的细胞质。

 2) 将细胞质悬在 75 ml 缓冲液 D 中。

 注:袖提缓冲液中的 0.42mol/L KC1 能用 0.42mol/LNaCl 来替代。

 3) 磁力搅拌器拌和 30 min。

 4)100OOOg 髙速抽滤 1 h, 沉定体细胞残片。

 注:对于步抽滤,提议用吊斗式扭头如 BeckmanSW28) 而无需定角式扭头。用后面一种会对细胞质造成不期待有的裁切功效。

 5) 测上清液體积(一般为 70~75 ml)。

 注:为制取供离体转录试验用的规范提取液,可将 100000 g 抽滤个人所得的上清液对含 0.1mol/LKCl 的 TM 缓冲液开展分析 6 另一个, 也可将硫酸铵沉淀物见下文对 TM 缓冲液+0.1mol/LKC1 开展分析。0.42mol/LKC1 提取液中带有髙水准的组蛋白 H1, 这是转录功效的潜在性阻遏物 (Crceton 等,1991)。硫酸铵沉淀可去除绝大多数组蛋白 II1, 因而,在试品对 TM 缓冲液+0.1mol/LKC1 开展分析前,先加硫酸铵对 0.42mol/LKC1 提取液作沉定解决。

 6) 每毫升上清液加 0.33 g 硫酸铵粉末状,5~10 min 内慢慢添加。

 注:在应用前约 5~10 min, 将硫酸铵结晶捣碎。硫酸铵粉末状有吸水性,受潮的疏酸铵难以**称重。咖啡生豆研磨器是碾磨琉醆铵的好器材,比研钵和杵好些促使多。

 7) 待全部硫酸铵融解后,化合物用磁力搅拌器拌和 30 min。

 8) 用 BeckmanSS-34 扭头,15000r/min 髙速抽滤 15 min, 沉定蛋白。

 9)将沉淀溶解约 3.5 ml 的 TM 缓冲液+0.1mol/LKCl 中,并使水溶液的终容积约为 5 ml。

 10) 个人所得奶白色化合物用 BeckmanSS-34 扭头,10000r/min 髙速抽滤10min, 去除不溶物。

 11) 上清液通常为奶白色,可立即上 S-300 柱开展疑胶过虑。用 Bradford(考马斯亮蓝法、以牛γ-血蛋白为参考,测量其蛋白质浓度值通常约为 50 mg/ml。

  12) 如必须, 可将提取液置液态氮中冷藏,-80°C 下可储存月余(乃至多年)。提取液溶化时要尽量得快些,这一点儿很关键。想要保证这一点儿,可将冷冻管置室内温度的水里,并除去将会在管周边产生的冰。提取液溶化后,关键的是用 BeckmanSS-34 头,10000r/min 髙速抽滤 10 min, 去除不溶物另一个方法是将此提取液对 TM 缓冲液+0.1mol/L KCl 分析数钟头,至试品的导电率与缓冲液相同,该细胞质提取液就能用以离体转录试验。


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