皮质醇 ELISA 试剂盒（Cortisol ELISA Kit）

1. 检测原理

本试剂盒采用**竞争性酶联免疫吸附试验（Competitive ELISA）**原理，用于定量检测血清、血浆、唾液、尿液等样本中的皮质醇（Cortisol）含量。

• 包被抗原：微孔板预包被皮质醇-蛋白结合物。

• 竞争结合：样本中的皮质醇与酶标皮质醇（HRP 标记）竞争结合有限量的抗皮质醇抗体。

• 显色反应：加入 TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物后，HRP 催化显色，颜色深浅与样本中皮质醇浓度成反比。

• 终止反应：加入终止液（稀硫酸）后，在 450 nm（参考波长 630 nm）处测定吸光度（OD 值）。

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2. 适用范围

• 样本类型：人/动物血清、血浆（EDTA/肝素抗凝）、唾液、尿液、细胞培养上清液等。

• 应用领域：

  • **诊断（库欣综合征、Addison 病、应激状态评估）。

  • 科研实验（HPA 轴功能研究、药物代谢分析）。

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3. 试剂盒组成

4. 样本采集与处理

• 血清/血浆：静脉采血后离心（3000 rpm，10 min），避免溶血。

• 唾液：使用专用唾液采集管，离心（10,000 rpm，5 min）去除颗粒物。

• 尿液：收集 24 小时尿或晨尿，调整 pH 至 7.0，离心后取上清。

• 储存：

  • 短期（≤7 天）：2-8°C。

  • 长期：-20°C 冻存（避免反复冻融）。

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5. 实验步骤

1. 试剂准备：

   • 洗涤缓冲液：1×PBS-T（1:20 稀释浓缩液）。

   • 标准品/样本恢复至室温（20-25°C）。

2. 加样与孵育：

   • 每孔加入 50 μL 标准品/样本 + 50 μL 酶标结合物 + 50 μL 抗体溶液。

   • 轻轻混匀，37°C 孵育 60 分钟。

3. 洗涤：

   • 弃去孔内液体，每孔加 300 μL 洗涤液，静置 30 秒后弃去，重复 5 次。

4. 显色：

   • 每孔加入 100 μL TMB 底物，避光室温反应 15 分钟。

5. 终止与读数：

   • 每孔加入 50 μL 终止液，立即在酶标仪读取 450 nm OD 值（参考波长 630 nm）。

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6. 数据分析

1. 标准曲线绘制：

   • 以标准品浓度（ng/mL）为横坐标（Log 刻度），对应 OD 值为纵坐标，拟合 4 参数逻辑曲线（4PL）。

2. 样本浓度计算：

   • 根据标准曲线方程，计算样本中皮质醇浓度。

   • 单位换算：1 ng/mL = 2.76 nmol/L。

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7. 注意事项

• 实验环境：室温（18-25°C），避免强光直射。

• 交叉污染：更换吸头避免标准品/样本间污染。

• 干扰因素：

  • 溶血、脂血样本需预处理。

  • 某些药物（如糖皮质激素、避孕药）可能影响结果。

• 质量控制：

  • 每批次实验需包含 空白孔（0 标准品） 和 质控样本。

  • 复孔检测 CV（变异系数）应 ＜10%。

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8. 参考范围

9. 储存与稳定性

• 未开封试剂盒：2-8°C 保存，有效期 12 个月。

• 开封后：

  • 酶标板：密封后 2-8°C 保存，1 个月内使用。

  • 标准品/抗体：-20°C 分装保存，避免反复冻融。

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10. 局限性

• 昼夜节律影响：建议固定采样时间（如上午 8-10 点）。

• 高浓度样本：需适当稀释后复测。

• ELISA 与 LC-MS/MS 差异：ELISA 可能存在交叉反应，必要时用质谱法验证。

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本说明书仅提供通用操作指南，具体实验条件需根据实际试剂盒优化。以上内容仅供参考。