谷胱甘肽 （GSH） 检测试剂盒

1. 检测原理

本试剂盒基于 DTNB（5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)比色法，用于定量检测生物样本中的还原型谷胱甘肽（GSH）。

• 反应原理：

  • GSH 中的巯基（-SH）与 DTNB 反应，生成 黄色产物 5-硫代-2-硝基苯甲酸（TNB⁻）。

  • TNB⁻ 在 412 nm 波长 处有*大吸收峰，吸光度（OD值）与 GSH 浓度成正比。

• 特异性：

  • 主要检测 还原型 GSH，不直接检测氧化型谷胱甘肽（GSSG）。

  • 如需测总谷胱甘肽（GSH + GSSG），需先用还原剂（如 NADPH + 谷胱甘肽还原酶）将 GSSG 还原为 GSH。

  • 
    

2. 适用范围

• 样本类型：

  • 动物/人 组织匀浆（肝、脑、肾等）。

  • 细胞裂解液（需去除蛋白）。

  • 血清/血浆（需避免溶血）。

  • 植物提取液。

• 应用领域：

  • 氧化应激研究（如 ROS 清除能力评估）。

  • 药物毒性或抗氧化剂效果检测。

  • 环境污染物对生物体 GSH 水平的影响。

  • 
    

3. 试剂盒组成

4. 样本前处理

1. 组织/细胞样本：

   • 取 50-100 mg 组织或 10⁶ 细胞，加入 冷 PBS（pH 7.4） 匀浆。

   • 离心（10,000 rpm，10 min，4°C），取上清。

   • 加入 等体积蛋白沉淀剂（如 5% 磺基水杨酸），混匀后离心（12,000 rpm，5 min），取上清待测。

2. 血清/血浆：

   • 直接加入蛋白沉淀剂（1:1 体积比），离心后取上清。

3. 储存：

   • 处理后的样本可在 -80°C 保存 ≤1 个月，避免反复冻融。

5. 实验步骤

1. 标准曲线制备：

   • 用 PBS 稀释 GSH 标准品（0, 2, 5, 10, 20, 50 μM）。

2. 反应体系（按 96 孔板为例）：

   组分	体积（μL）
   样本/标准品	50
   PBS（0.1M, pH 8.0）	50
   DTNB 显色剂	10

3. 反应与检测：

   • 混匀后室温避光反应 10 分钟。

   • 用酶标仪或分光光度计测定 412 nm 处 OD 值。

6. 数据分析

1. 标准曲线：

   • 以 GSH 标准品浓度（μM）为横坐标，OD₄₁₂ 为纵坐标，绘制线性回归曲线。

2. 样本计算：

   • 根据标准曲线方程计算样本 GSH 浓度。

   • 单位换算：

     • 组织样本：μmol/g 蛋白（需测蛋白浓度校正）。

     • 细胞样本：nmol/10⁶ 细胞。

7. 注意事项

• 避免氧化：

  • 样本处理需在 冰上操作，防止 GSH 被氧化为 GSSG。

  • 可加入 1 mM EDTA 抑制金属离子催化氧化。

• 干扰因素：

  • 高浓度 DTT、β-巯基乙醇等还原剂会干扰 DTNB 反应。

  • 血红蛋白（溶血样本）可能影响吸光度。

• 质量控制：

  • 每批次实验需包含 空白对照（PBS + DTNB）。

  • 复孔检测 CV（变异系数）应 ＜8%。

8. 参考范围

9. 储存与稳定性

• 未开封试剂盒：2-8°C 保存，有效期 6 个月。

• DTNB 显色剂：开封后 2-8°C 避光保存，1 个月内使用。

10. 局限性

• 仅检测还原型 GSH：如需测总谷胱甘肽（GSH + GSSG），需额外还原步骤。

• 灵敏度限制：低浓度样本（＜0.5 μM）建议使用荧光法或 HPLC 法。

本说明书为通用指南，具体操作请根据实验需求优化。以上信息仅供参考