V A C K 裂解缓冲液!!

   基 本 方 案 从 脾 脏 、胸腺和淋巴结制备细胞悬液

 

材 料

 

  RPMI-5 或 DMEM-5 完全培养基

 

  新鲜分离的小鼠器官： < 6 周龄的小鼠胸腺； 6 周 至 6 个月龄的小鼠脾脏和淋巴结

 

  60 mmX 15 mm 培养皿

 

  剪 刀 和 镊 子（保 存 在 7 0 % 乙醇的烧杯中）

 

  装 有 19 G 针 头 的 6 ml 注射器

 

  200um 尼龙滤网

 

   1 . 将新鲜分离的器官放入盛有 3 ml RPMI-5 或 DMEM-5 完 全 培 养 基 的 60 mm X15 mm培 养 皿（每种器官一个培养皿）中，用剪刀将器官剪碎。

 

   2 . 用 6m l 注射器的活塞将组织块向培养皿底面用力挤压直到仅剩纤维组织。

 

   3 . 用 装 有 19 G 针 头 的 6 ml 注射器将组织悬液反复抽吸数次，以进一步粉碎组织团块。

 

   4 . 将细胞悬液通过 200 Mm 尼龙滤网滤入离心管中。用 约 4m l 完全培养基洗一次培养皿 ，如需要则重复一次，之后将洗液通过滤网加入离心管中。 

 

   5.在 Sorvall H-1000B 离心机中以 lOOOr/min (200 g) 离 心 IOmin 后 弃 上 清（如需要去除红细胞和死细胞，见辅助方案）。用 20m l 完全培养基将沉淀重悬后离心，再以适量培养基重悬以便计数（附 录 3A)。

 

   6 . 如细胞不能立即处理，的保持细胞活力的办法是将细胞悬液置于冰块中。这种处理也能减少因细胞贴壁引起的细胞损失（单 元 2. 3)。

 

辅 助 方 案 1 去除脾脏细胞悬液中的红细胞

 

   脾脏细胞悬液在进行淋巴细胞计数之前先去除红细胞（RBC)。胸腺和淋巴结细胞悬液则不必去除红细胞。脾脏细胞的亚群分离也需先去除红细胞。

 

附 加 材 料（其他材料见基本方案，带 V 项 目 见 附 录 1)

 

V A C K 裂解缓冲液

 

   1 . 每个脾脏用约 5 ml 裂解缓冲液悬浮脾脏细胞；一 个 12 ml 试管可用于裂解一个或两个脾脏 ，也可以用 50 ml 离心管裂解更多的脾脏。

 

   2 . 室温孵育 5 min，间以摇动。

 

   3 . 加入洗液直 至 装 满 容 器 ，在 低 速 离 心 机 上 以 200 g 离 心 IOmin 后 弃 上 清 。再洗沉淀 一 次 并 以 适 量 培 养 基 重 悬 以 便 下 一 步 操 作（如 去 除 死 细 胞 、细胞计数或者细

胞分 离）。辅 助 方 案 2 —步梯度法去除死细胞下面介绍的方法，其基本原理是基于活细胞（密度较小）和 死 细 胞（密度较大）密度不同，从而有助于将活的淋巴细胞与红细胞分离。

 

（小鼠单个核细胞）附加材料

 

   高密度溶液： Ficoll-Paque (Ficoll 和 泛 影 酸 納 ； Pharmacia LKB) 或 Lympholyte——M(Cedarlane)

12m l 或 50m l 聚 丙 烯 离 心 管（比聚苯乙烯离心管好）