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继代营造和测序!

   乙状结肠直肠肿瘤身体细胞的营造

 实验方法 基本概念通常用酶消化囊腺瘤,用手术刀片将癌组织切碎。倘若瓦解上等的乙状结肠直肠癌标本采集划开后仍不易提取身体细胞,可用酶消化方法 提取。

 实验原料用于传代培养的Dispase样品、试剂盒发肓细胞培养液洗液胃蛋白酶实验仪器、耗品营造瓶

 实验步骤(乙状结肠直肠肿瘤身体细胞)

 一、酶消化

 1. 用洗液(洗液:再加 5% FBS、200 U/ml 头孢类、200 μg/ml 链霉素和 50 μg/ml 庆大霉素。在原代营造时,庆大霉素的作用至少维持7天,接着除去。)清除良性肿瘤标本采集 4 次。

 2. 将组织块放入小量洗液中,洗液恰好渗入组织块(避免组织干)。用社会上也无法交差的手术刀片或锋利手术剪将组织块剖成约 1 mm3 一片片。

 3. 依据用台式离心机抽滤(300 g,3 min),将组织块清除 4 次。清除次数以工作经历而定,并根据身体细胞空气污染情况。

 4. 将组织块放入胃蛋白酶(胃蛋白酶:DMEM,再加的抗菌药同洗液,并再加 1.5 mg/ml 胶原蛋白酶( IV型,Worthington)、0.25 mg/ml 透明质酸酶( I 型,Sigma)和 2.5%~5% FBS。尽管普遍 Worthington 公司生产加工的胶原蛋白酶,也可应用 Sigma 公司生产加工的营造级别的胶原蛋白酶。),在 37℃ 规范下摇晃,通常借宿(约 12~16 h )。由于消化是1个缓慢过程,组织块在胃蛋白酶中的时间多少钱并不要紧,重要的是在这边过程中不能胃蛋白酶变为酸碱度。低 pH 说明组织块在胃蛋白酶中的时间过长或放入胃蛋白酶中的组织块过多。将约 1 cm3 良性肿瘤组织放入 20~40 ml 胃蛋白酶。

 二、非酶消化

 囊腺瘤始终务必用酶消化。却不知道,常发现再用手术刀片将癌组织切成 1 mm3 、时小的身体细胞簇从良性肿瘤组织往下掉入洗液中。在这种事情,可按下列步骤操作过程。

 1. 收集含有往下掉身体细胞簇的洗液。

 2. 将离心管放置十几分钟,依据相互作用力使身体细胞簇混凝土裂缝,将组织块与小的身体细胞簇分离出来。

 3. 抽出来上清液。

 4. 马上营造剩下组织块,或者将组织块放入洗液内,轻轻摇晃 30~60 min,有利于使很多的小细胞簇脱落下来,接着收集身体细胞簇,种植于培养皿内,与剩余的组织块分离出来营造。

 5. 在种植于培养皿内之前,将所有标本采集洗 3 次。

 三、原代营造的标准规范

 1. 在浸涂胶原蛋白和种植饲养身体细胞的 25 cm2 营造瓶,用 4 ml 细胞培养液营造从良性肿瘤组织提取的鳞状上皮细胞性小管和身体细胞簇。

 2. 在含有 5% CO2 和 37 ℃ 的营造箱里营造。

 3 . 每周换细胞培养液2次。

 小管和身体细胞在 1~2 d 内一开始黏附底物,上皮细胞迁移出来。绝大多数小管和小的鳞状上皮细胞块在 7 d 内贴壁,但大的类内脏器官物务必 6 周可以贴壁,尽管贴壁时间有必须的变化。

 倘若将身体细胞加入于浸涂胶原蛋白的营造瓶(Biocoat,B-D Biosciences),在原代营造过程中鳞状上皮细胞容易贴壁。与无 3T3 词养层比照,将身体细胞加入于 3T3 饲养层处时身体细胞发肓非常好。当上皮细胞拷贝扩升到每个拷贝有十几个身体细胞时,她们愈来愈不在于 3T3 饲养层,故无须再加上词养层身体细胞。

 四、继代营造和测序

 不能用基础的胰蛋白酶和 EDTA 水溶液处理方法 对绝大多数乙状结肠直肠腺瘤的原代身体细胞和囊腺瘤细胞系进行传代 [ Paraskeva et al., 1984,1985 ]。由于用 0.1 % 胰蛋白酶(用 0.25 mmol/L EDTA 配备)将囊腺瘤身体细胞分散为单细胞导致身体细胞发肓很差,故改成 Dispase。

 1. 将 Dispase 液注于身体细胞单双面上,恰好渗入身体细胞(每个 25 cm2 营造瓶约 2.5 ml)。对原代身体细胞处理 40~60 min,而对细胞系处理 20~40 min。

 2. —旦上皮细胞层一开始去黏附(去黏附的是身体细胞片,而并非单细胞),用一次性吸管吹打,以促进去黏附,使身体细胞片分散成身体细胞簇。

  3. 在标准的营造规范下清除和种植身体细胞。几天后身体细胞簇去黏附,故应缓缓的换液。

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