EGF（B-D Biosciences）

     试验方式基本原理胰蛋白酶消化吸收后，用 EDTA 分散化从肌肤片分离出来的外皮片，随后用加上 bFGF（FGF-2）的无血细胞细胞培养液塑造。

试验原材料

  D-PBSA胎牛血清黄豆胰蛋白酶抑制剂实验试剂、试剂盒

  加上生长激素的黑色素细胞细胞培养液胰蛋白酶和EDTA溶液仪器设备、耗品

  机构培养皿塑料吸管离心管潮湿的恒温箱水浴箱电子器件体细胞计数仪或血细胞计数板试验流程

黑色素细胞原代塑造

第 1 天

  1. 用 70 % 酒精侵泡肌肤标本采集，随后用 D-PBSA 侵泡 2 次。

  2. 将机构移进无菌检测 100 mm 培养皿，外皮脸朝下。

  3. 用解剖学剪去去人体脂肪和浅层牛皮。

  4. 将剩下的机构用手术刀切割成 2 mm × 2 mm 一块块。刀头在组织上摇晃，但不必选用锯切。

  5. 将机构块移进盛有冷的 0.25 % 胰蛋内酶的 15ml 离心管。

  6. 在室内温度标准下，将机构块孵育 60~90 min 。针对一些供体的肌肤，先往 4°C 标准下孵育 18~24 h，随后在 37°C 标准下孵育 1~2 h，那样可得到较多的黑色素细胞。

第 2 天

  7. 轻轻拍打离心管，使沉到底端的机构块挪动。随后，将离心管内的內容物迅速倒进 60 mm 培养皿。

  8. 用手术治疗镊将机构块逐个地移进 100 mm 干培养皿，上皮细胞脸朝下。轻轻地摇晃机构块，使其触碰培养皿底壁。应以表皮粘附在培养皿上，便于用手术治疗镊完全分离出来牛皮。去除牛皮片。

  9. 将外皮片移进盛满 5 ml 0.02% EDTA （0.7 mmol/L）的 15 ml 离心管。留意将外皮片放进 EDTA 液，不必贴在离心管内壁。

  10. 轻轻摇晃离心管，使外皮片分散化成单细胞。

  11. 抽滤（350 g，5 min），随后吸掉上清液。

  12. 用 MHSM 混悬体细胞。

  13. 用血细胞计数板记数体细胞，随后在 35 mm 培养皿用 2 ml 带有 5 % FBS 的 MHSM 孵育体细胞，体细胞相对密度为1×106 个（约2×104~4×104 个黑色素细胞）。FBS 推动体细胞贴壁。

  14. 用带有细胞生长因子和牛脑垂体提取液的 MHSM 换液，每星期 2 次。

第 3~30 天

  15. 塑造 24 h 后，塑造的体细胞中带有原代角质层产生体细胞和散在的黑色素细胞。角质层产生体细胞在几日后终止增殖，角质层产生体细胞复制在第 2 周浮上来。第 2 礼拜天，只剩有黑色素细胞。在大部分状况下，体细胞在 2~4 周后生长发育贴近汇聚，这时提前准备传代。

传代培养

  16. 用 0.02% EDTA（0.7 mmol/L）轻轻地侵泡体细胞 2 次。

  17. 添加 3 ml 0.25 % 胰蛋白酶和 0.1 % EDTA（2.5 mmol/L）溶液，在 37°C标准下孵育。每 5 min 在相差显微镜下观查 1 次，检査体细胞的去粘附状况。

  18. 当大部分体细胞去粘附时，用 10 μg/ml 黄豆胰蛋白酶抑制剂或 1 ml 带有小牛血清的细胞培养液使胰蛋白酶降解。传代时，“血淸刺激性”有利于在无血细胞标准下保持黑索体细胞生长发育。

  19. 吹打培养皿中的体细胞，确保所有黑色素细胞去粘附。

  20. 吸出来体细胞悬浮液，抽滤（350 g，5 min )。

  21. 吸掉上淸液，用带有 5 % FBS 的无钙黑索细胞培养液混悬体细胞。每一 100 mm 培养皿内放进 2×104~ 4×104 个体细胞。黑色素细胞非常好地贴于塑胶培养皿（> 75 % ) 要 FBS。可是，假如培养皿有涂纤连蛋白或 Ⅰ 型胶原蛋白粉和 Ⅲ 型胶原蛋白粉化合物，可无需 FBS [  Gilchres te al.，1985 ] 。

  22. 用无血细胞或带有血淸的黑色素细胞细胞培养液换液，每星期 2 次。用带有血细胞的细胞培养液塑造能得到较多的体细胞，但带有血淸的细胞培养液推动成纤维细胞的生长发育。将 Ca2＋浓度值降到 0.03 mmd/L 不危害黑色素细胞的增殖，但抑止成纤维细胞的过度生长 [ Naeyaert et al.，1991 ]。

加上生长激素的黑色素细胞细胞培养液（melanocyte hormone-supplemented medium，MHSM）：

  (a)199 细胞培养液（400-1200，GIBCO）：93.1 ml；

  (b)EGF（B-D Biosciences）：0.1 ml，存储浓度值为 10 μg/ml，*终浓度值为 10 ng/ml；

  (c)转铁蛋白（Sigma）：0.1 ml，存储浓度值为 10 mg/ml，*终浓度值为 10 μg/ml；

  (d)甘精胰岛素（Sigma）：0.1 ml，存储浓度值为10 mg/ml，*终浓度值为 10 μg/ml；

  (e)三碘甲状腺囊肿原氨酸（Sigma）：0.1 ml，存储浓度值为 1 μmol/L，*终浓度值为 1 nmol/L；

  (f)空气氧化可的松（Calbiochem）：0.5 ml，存储浓度值为 0.28 mmol/L，*终浓度值为 1.4 μmol/L；

  (g)霍乱内毒素（Calbiochem）：1.0 ml，存储浓度值为 1 μmol/L，*终浓度值为 1 nmol/L。能用牛脑垂体提取液和双丁酸环腺背酸替代霍乱内毒素。牛脑垂体提取液（Clcmetics）的存储浓度值为 35 μg/ml，*终浓度值为 0.7 ng/ml。双丁酸环腺汗酸（Sigma）的存储浓度值为 1 mmol/L，*终浓度值为 100 μmol/L；

  (h)bFGF（Amgen）：5.0 ml，存储浓度值为 200 ng/ml，*终浓度值为 10 ng/ml。

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