小白鼠甲状腺鳞状上皮细胞试验原材料

小白鼠甲状腺鳞状上皮细胞试验原材料：

1. 10-12周龄怀孕小白鼠甲状腺机构

2. 没有Ca 2+ 和Mg 2+ 的1×PBS，加上200000IU/L头孢类、200mg/L链霉素和200000U/L庆大霉素，pH7.4

3. FBS、含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS液或DMEM

4. 0.05%Ⅰ型胶原酶50ml、0.05%胰蛋白酶50ml、0.1%DNaseⅠ型、结晶紫（0.1%）/枸橼酸（0.1mol/L）

5. 细胞培养液：血细胞细胞培养液（DMEM或F12+10%FBS）、无血细胞培养液（DMEM:F12为1：1，加甘精胰岛素1-5μg/ml、转铁蛋白10μg/ml、BSA1-5mg/ml等）。胶原蛋白疑胶铺底液（酸碱性胶原蛋白液或自做鼠尾胶原，10×F12，用缓冲液稀释液）

6. 分裂培养液：为DMEM/F12按1：1（容积比）占比配置的混和培养液，加上5μg/ml甘精胰岛素、1μg/ml氢化可的松、3μg/ml泌乳素和50μg/ml庆大霉素。在其中，泌乳素以3μg/ml浓度值溶解10mmol/L NaOH中，过滤除菌，4℃下可储存2周，应用前加上到培养液中。

7. C中性蛋白酶水溶液：为9.6μg/ml的Dispase水溶液，用DMEM配置。

8. 手术刀、解剖学剪、解剖学镊、骨科剪，骨科镊

9. 离心管（15ml、50ml）、10cm塑胶培养皿、300ml有盖的三角形烧瓶（2个，解决胶原酶及胰蛋白酶用）、髙压杀菌的带涤纶网（直径150μm）的量杯

10. 厚胶原蛋白胶的制取：以8：1：1（容积比）的占比配置鼠尾胶原、F12与NaHCO 3 /NaOH的溶液做为包被液。包被液的多组分包含鼠尾胶源液、10×浓度值的F12、0.26mol/L NaHCO 3 和0.125 mol/L NaOH溶液。各自除菌。将包被液和塑造板在4℃下预冷。随后，按150μl/cm 2 的使用量加进塑造容器内。置37℃下1h，用细胞培养液洗2次（每一次30min），随后添加血细胞-胎血蛋白溶液。

小白鼠甲状腺鳞状上皮细胞试验方式：

1. 麻醉剂处决小白鼠，75%酒精消毒杀菌，放置蜡板上，用大头钉固定不动手脚。用正中心线裁开肌肤，用钳子引开肌肤，用大头针固定不动在板上。切下来约5g甲状腺脂肪细胞，放进配有PBS液的培养皿内清洗3次。

2. 用刀头不断激光切割、或用剪子剪碎甲状腺至粘稠。随后将机构碎渣挪到三角形烧瓶内，加50ml胶原酶，置37℃恒温水浴中水准震荡1-2h（100-200次/min）。

3. 当无大面积机构块时，用涤纶网将体细胞滤至量杯内，以去除未消化的机构。渗沥液挪到5ml离心管内，1000r/min抽滤约3min，去上清，加PBS液2ml在手上振摇使体细胞团大散，移进配有50ml胶原酶的三角形烧瓶内，这时候见面一部分体细胞悬浮液中出現山雾状，经10-15min之后消退。放进37℃恒温水浴中迟缓水准振摇30min（30次/min）。

4. 加10%血细胞或BSA约5ml，同上法用涤纶网过虑，以1000r/min抽滤约1min。向体细胞团中立即加血细胞或BSA约1ml，拍打离心管，打撒体细胞团（这时体细胞敏感，通常不开展吹打）。挪到10ml离心管中，加5mlPBS液搅拌，以1000r/min抽滤约1min，清洗体细胞3次，可去除成纤维细胞和血细胞。

5. *后向体细胞团里加血细胞或BSA，打撒体细胞团，加5-10mlPBS液吹打10次上下，使其成为均一的体细胞悬浮液，记数体细胞数。用此法分离出来的体细胞多呈小块，没办法恰当记数，必需时要0.1ml体细胞悬浮液加0.9ml结晶紫，强烈振摇体细胞约1min，这时体细胞易毁坏进而胞核上色，可计数蓝染细胞质数。1克机构约可取货5×10 6 —10×10 6 个体细胞。

6. 获得的体细胞用含10%FBS的DMEM或无血细胞细胞培养液飘浮，将所述消化吸收的甲状腺鳞状上皮细胞以相对密度为1.0×10 5 —2.5×10 5 个/cm 2 将其打疫苗在厚胶原蛋白胶纸包被的塑造板上，添加细胞分化培养液开展塑造。

7. 塑造72h，待细胞融合后，用移液器离心管或体细胞刮刷将胶原蛋白膜与塑造板底边分离出来，使胶原蛋白膜收拢并飘浮在培养液中，以后每2-3d拆换一回细胞培养液。

8. 体细胞传代。消化吸收水溶液为10×胰蛋白酶-EDTA混和消化酶，在37℃下孵育7min。另一个，应用中性蛋白酶水溶液做为消化酶。实际操作给出：原代细胞培养后，用DMEM培养液洗塑造板，再用1/4封闭液（2.4μg/ml）的中性化蛋白质液洗塑造板2次。添加100μl/cm 2 的Dispase水溶液，于37℃静放20min。再添加5%胎牛血清的DMEM/F12细胞培养液以停止消化吸收。

9. 再用含5%胎牛血清的DMEM/F12抽滤清洗沉定体细胞（250r/min，4min）。抽滤完用5%胎牛血清的DMEM/F12细胞培养液再次飘浮体细胞。

10. 将体细胞悬浮液以1.0×10 5 —2.5×10 5 个/cm 2 的体细胞相对密度打疫苗，塑造在生长发育培养液中。假如用以分裂塑造，打疫苗24-48h后可拆换为分裂培养液。

11. PriCells-原代鳞状上皮细胞特别制作基本培养液

12. PriCells-原代鳞状上皮细胞塑造特别制作防腐剂

13. PriCells-原代体细胞分离出来试剂盒

14. PriCells-原代体细胞评定试剂盒

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