大白鼠脑毛细血管内皮细胞原代塑造

  大白鼠脑毛细血管内皮细胞原代塑造可用以：（1）血脑屏障的科学研究；（2）脑血管病的病理学生理学及生物学科学研究；（3）药物刷选；（4）脑毛细血管内皮细胞生理学生物化学及药学科学研究。

   试验方式基本原理以大脑皮层为原材料、酶消化吸收及系数离心分离脑毛细血管段并开展原代塑造，取得成功地探求出大白鼠脑毛细血管内皮细胞分离出来和原代塑造的方式，并得到纯净度较高的脑毛细血管内皮细胞。

试验原材料SD大白鼠实验试剂、试剂盒纤连蛋白Ⅳ型胶原蛋白胶状物肝素钠偏碱成纤维细胞细胞生长因子头孢类链霉素NaHCO3牛血清白蛋白鼠尾胶葡聚糖DNA酶ID-Hanks＇液II型胶原酶仪器设备、耗品超低温离心脱水机离心管移液枪

试验流程

一、试验原材料提前准备

1.  实验动物

每一次试验选用10只2-3周龄SD大白鼠，雌和雄均可，休重40~60 g。

2.   仪器设备

超低温离心脱水机(Centrifuge 5810 R，购自Eppendorf；Himac CR 22F，购自Hitachi)。

3.  实验试剂配置

（1）1 mg/ml鼠尾胶(用0.2%甲酸配置)，1%胶状物(用D-Hanks＇液配置)，1%II型胶原酶(用DMEM配置，耗时稀释液成0.1%的浓度值)，1%胶原酶/分散酶(用DMEM配置，耗时稀释液成0.1%)，15%葡聚糖(用PBS配置)，20% BSA(用DMEM配置，调pH值至7.4完用0.45 μm滤纸过滤除菌，较难过虑)，DNase I(用冷PBS配置成2 U/μl)，左右实验试剂经0.22 μm滤纸过滤除菌后预包装储存于-20℃。

（2）50%Percoll(配12 ml，需6 ml Percoll源液，0.67 ml 10×PBS，0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM细胞培养液(含4000 mg/L D-果糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，加上3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素钠 100 mg/L，头孢类 100 U/ml，链霉素 100 μg/ml)，pH值调为7.4，过滤除菌后预包装储存于4 ℃，耗时添加20% FBS及1 ng/ml bFGF。

二、培养皿归一化处理

1.  施胶3种不一样的栽培基质，塑造头天添加1 ml 1%胶状物于35 mm塑胶培养皿，放置37 ℃恒温箱留宿，打疫苗前要D-Hanks＇液浸洗2次。

2.  打疫苗前4 h，添加鼠尾胶6~10 μg/cm2，在密闭式的容器里用二氧化氮熏5~10 min后，放置室内温度1~2 h晾晒后，用D-Hanks＇液浸洗2次。

3.  50 μl 0.1%纤连蛋白、50 μl 1 mg/ml Ⅳ 型胶原蛋白和400 μl双蒸水混和后，添加到每一培养皿中施胶匀称后吸出来，可施胶10个培养皿，放置37 ℃恒温箱1~2 h晾晒后，用D-Hanks＇液浸洗2次。

三、脑毛细血管段的分离出来与脑毛细血管内皮细胞（大白鼠脑毛细血管内皮细胞）原代塑造

1.  大白鼠颈椎骨脱位处决后侵泡于75%酒精中消毒杀菌3~5 min后断掉放置夹层玻璃培养皿中，开启颅腔后取下全脑放置盛满冷D-Hanks＇液的夹层玻璃培养皿中解剖学除去丘脑、间脑(包含海马)。

2.  接着将大脑半球在干过滤纸上迟缓翻转以吸除软脑膜及脑膜大毛细血管后放置新的含冷D-Hanks＇液夹层玻璃培养皿中，用细解剖学镊除去大脑白质、残留大毛细血管和软脑膜，保存大脑皮层。

3.  用D-Hanks＇液浸洗3次后，添加1 ml DMEM细胞培养液，用视网膜剪将其剪碎成1 mm3尺寸，添加0.1%Ⅱ型胶原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/人的大脑)搅拌后37 ℃水浴消化吸收1.5 h。

4.  抽滤(1 000 rpm，8 min，室内温度)，去上清液，添加20% BSA飘浮搅拌后抽滤(1000 g，20 min，4 ℃)或添加15%葡聚糖飘浮搅拌后抽滤(4 000 rpm，20 min，4 ℃)，除去中上层神经系统机构及大毛细血管，保存底端沉定。

5.  添加2 ml 0.1%胶原酶/分散酶(含20 U/ml DNase I)飘浮搅拌后37 ℃水浴消化吸收1 h，抽滤(1 000 rpm，8 min，室内温度)，去上清液，添加2 ml DMEM细胞培养液飘浮后铺于经抽滤产生连续梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g，60 min，4 ℃)。

6.  抽滤(1 000 g，10 min，4 ℃)，挨近底端的血细胞层之中的白淡黄色的方面即是提纯的毛细血管段，吸出来完用DMEM浸洗2次(抽滤1 000 rpm，5 min，室内温度)，去上清液。

7.  添加DMEM彻底细胞培养液(含20% FBS，100 μg/ml肝素钠)飘浮后打疫苗于施胶栽培基质的35 mm一次塑胶培养皿(1.5 ml/培养皿，可打疫苗1个培养皿/人的大脑)，放置37 ℃、5%CO2塑造箱里静放塑造，12~24 h后换液，并添加1 ng/ml bFGF，接着**天换液。

四、评定方式

形态学、Ⅷ系数有关抗原免疫力组织化学检验。

五、結果

1.   体细胞形状观查

   打疫苗那时候看得见由环形的内皮细胞组成的呈单枝状或发枝状的脑毛细血管段，并看得见散在的单细胞及机构残片(见图1-1)；塑造12~24 h后看得见塑造的体细胞从贴壁的毛细血管段周边长出，体细胞呈短梭形，地区性单面生长发育，经换液后毛细血管段的残留一部分持续降低，成纤维细胞、周体细胞等杂体细胞含水量偏少；随之塑造時间的增加，内皮细胞持续增殖，看得见"涡旋"遍布，大概5~7天体细胞超过结合，短梭形的内皮细胞占90%左右，但看得见小量周体细胞等杂体细胞生长发育于内皮细胞单面表层或体细胞复制空隙(結果未显示信息)。体细胞生长发育全过程见图1，体细胞打疫苗于纤连蛋白/Ⅳ型胶原蛋白施胶的培养皿。

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